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Fehlerbehebung bei PCR und RT-PCR-Amplifikation
| Problem | Mögliche Ursache |
|---|---|
| Keine Bänder auf dem Gel | Verlängerungszeit war zu kurz |
| Thermocycler hatte nicht die richtige Temperatur | |
| Zusätzliche, unspezifische Banden auf dem Gel | Primer hybridisierten an eine sekundäre Stelle auf dem Template |
| DNA-Kontamination wurde in Primer oder Puffer eingeführt |
- Was verursacht PCR-Versagen??
- So beheben Sie ein PCR-Problem?
- Was würden Sie tun, wenn die PCR-Amplifikation einer Probe fehlgeschlagen ist??
- Was passiert, wenn Sie der PCR zu viel Primer hinzufügen??
Was verursacht PCR-Versagen??
Normalerweise geben Forscher als erstes einem fehlerhaften Enzym oder Reagenz die Schuld, wenn ein Experiment fehlschlägt, aber bei der PCR ist dies weniger wahrscheinlich die Ursache für das Scheitern. Häufiger sind tiefere interne Probleme wie Primer-Design, Thermocycler-Parameter oder unspezifische Bindung an andere Template-Sequenzen die Ursache.
So beheben Sie ein PCR-Problem?
Amplifikationslängenfähigkeit der ausgewählten DNA-Polymerasen prüfen. Verwenden Sie DNA-Polymerasen, die speziell für lange PCR entwickelt wurden. Wählen Sie DNA-Polymerasen mit hoher Prozessivität, die lange Ziele in kürzerer Zeit amplifizieren können. Reduzieren Sie die Annealing- und Extensionstemperaturen, um die Primerbindung und die Enzymthermostabilität zu unterstützen.
Was würden Sie tun, wenn die PCR-Amplifikation einer Probe fehlgeschlagen ist??
Wenn eine Amplifikationsreaktion fehlschlägt und Sie vermuten, dass die DNA-Matrize mit einem Inhibitor kontaminiert ist, fügen Sie das verdächtige DNA-Präparat zu einer Kontrollreaktion mit einem DNA-Matrizen- und Primer-Paar hinzu, das in der Vergangenheit gut amplifiziert wurde .
Was passiert, wenn Sie der PCR zu viel Primer hinzufügen??
Die Verwendung höherer Konzentrationen von Primern kann folgende Auswirkungen haben: Wenn die Primer in der Lage sind, Dimere zu bilden, führt eine Erhöhung ihrer Konzentration nur zur Bildung von Primer-Dimeren und verbessert nicht die Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts.
